蛋白磷酸化是一種非常重要的翻譯后加工，做信號通路必然是要檢測蛋白磷酸化的，Western blot是評估蛋白磷酸化狀態(tài)的常用方法，其實(shí)和跑正常蛋白沒(méi)什么出入，只不過(guò)孵育的是識別磷酸化的抗體。下面恒遠生物帶大家總結一下實(shí)驗中的注意要點(diǎn)。
一、關(guān)于磷酸化蛋白樣品
裂解液?jiǎn)?wèn)題蛋白的磷酸化是一個(gè)非常迅速的反應，取樣品的過(guò)程要迅速，樣品要新鮮，樣品處理要在冰上操作，操作時(shí)間盡量短。用PBS洗滌細胞時(shí)，PBS一定要4℃預冷。如果是組織的話(huà)，提取蛋白時(shí)采用液氮研磨的方法，研磨器具要提預冷，保持低溫的狀態(tài)。
提取磷酸化蛋白的裂解液新鮮配制，裂解液中一定要有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，否則即使條帶壓出來(lái)也會(huì )很淺，結果也不可信。okadaic acid，NaF是磷酸酶抑制劑。再者，還要看你檢測的蛋白磷酸化位點(diǎn)是什么氨基酸，如果是酪氨酸還要加1 u M的sodium vanidate即原釩酸鈉，上樣不要煮沸，煮沸可能會(huì )破壞其磷酸化位點(diǎn)。
二、關(guān)于WB時(shí)背景和條帶的問(wèn)題
磷酸化蛋白WB時(shí)背景也往往較深，所以壓片時(shí)間要適當，不能太長(cháng)或過(guò)短，太長(cháng)則背景太深蓋住想要的那條帶，時(shí)間過(guò)短則可能沒(méi)有條帶或者條帶太淺。做磷酸化蛋白WB時(shí)，除了目標蛋白的條帶以外，往往會(huì )出現非特異性的條帶。磷酸化抗體不好的話(huà)，甚至會(huì )壓出非特異性的條帶，反而沒(méi)有你想要的條帶，所以壓片后，一定要根據Markers比對一下你壓出的條帶分子量是否正確。
三、關(guān)于蛋白總的表達量問(wèn)題
研究完某一蛋白的磷酸化情況后也要研究一下該蛋白總的表達量。這有兩種方法，一是：相同的樣品在不同的孔中上樣兩次（可在相同的膠上，也可在不同的膠上），其一壓磷酸化蛋白，另一壓該蛋白總的表達量（包括磷酸化和未磷酸化的該蛋白），甚至還可跑另一個(gè)膠，壓內標。但是一般不建議如此做，因為這樣比較時(shí)誤差還是較大的。因此，比較公認的，也是常用的方法，即用strip液將原先結合上的磷酸化抗體及二抗洗去，然后用同一張膜壓總蛋白。然后再洗脫一次，再壓內標。
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