蛋白磷酸化是一種非常重要的翻譯后加工,做信號通路必然是要檢測蛋白磷酸化的,Western blot是評估蛋白磷酸化狀態(tài)的常用方法,其實(shí)和跑正常蛋白沒(méi)什么出入,只不過(guò)孵育的是識別磷酸化的抗體。下面恒遠生物帶大家總結一下實(shí)驗中的注意要點(diǎn)。
一、關(guān)于磷酸化蛋白樣品
裂解液?jiǎn)?wèn)題蛋白的磷酸化是一個(gè)非常迅速的反應,取樣品的過(guò)程要迅速,樣品要新鮮,樣品處理要在冰上操作,操作時(shí)間盡量短。用PBS洗滌細胞時(shí),PBS一定要4℃預冷。如果是組織的話(huà),提取蛋白時(shí)采用液氮研磨的方法,研磨器具要提預冷,保持低溫的狀態(tài)。
提取磷酸化蛋白的裂解液新鮮配制,裂解液中一定要有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑,否則即使條帶壓出來(lái)也會(huì )很淺,結果也不可信。okadaic acid,NaF是磷酸酶抑制劑。再者,還要看你檢測的蛋白磷酸化位點(diǎn)是什么氨基酸,如果是酪氨酸還要加1 u M的sodium vanidate即原釩酸鈉,上樣不要煮沸,煮沸可能會(huì )破壞其磷酸化位點(diǎn)。
二、關(guān)于WB時(shí)背景和條帶的問(wèn)題
磷酸化蛋白WB時(shí)背景也往往較深,所以壓片時(shí)間要適當,不能太長(cháng)或過(guò)短,太長(cháng)則背景太深蓋住想要的那條帶,時(shí)間過(guò)短則可能沒(méi)有條帶或者條帶太淺。做磷酸化蛋白WB時(shí),除了目標蛋白的條帶以外,往往會(huì )出現非特異性的條帶。磷酸化抗體不好的話(huà),甚至會(huì )壓出非特異性的條帶,反而沒(méi)有你想要的條帶,所以壓片后,一定要根據Markers比對一下你壓出的條帶分子量是否正確。
三、關(guān)于蛋白總的表達量問(wèn)題
研究完某一蛋白的磷酸化情況后也要研究一下該蛋白總的表達量。這有兩種方法,一是:相同的樣品在不同的孔中上樣兩次(可在相同的膠上,也可在不同的膠上),其一壓磷酸化蛋白,另一壓該蛋白總的表達量(包括磷酸化和未磷酸化的該蛋白),甚至還可跑另一個(gè)膠,壓內標。但是一般不建議如此做,因為這樣比較時(shí)誤差還是較大的。因此,比較公認的,也是常用的方法,即用strip液將原先結合上的磷酸化抗體及二抗洗去,然后用同一張膜壓總蛋白。然后再洗脫一次,再壓內標。
更多實(shí)驗資訊可咨詢(xún)我司業(yè)務(wù)員。上海恒遠生物科技有限公司擁有自己的實(shí)驗室,備有業(yè)的技術(shù)研發(fā)團隊,對于各種生物試劑,細胞,血清,ELISA試劑盒的研發(fā)與銷(xiāo)售,實(shí)驗提供免費代測服務(wù),并提供精湛的技術(shù)服務(wù),如果您有實(shí)驗上的問(wèn)題歡迎來(lái)咨詢(xún),為您提供業(yè)的一對一技術(shù)指導。
原創(chuàng )作者:上海恒遠生物科技有限公司